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如何選擇二抗?

時間:2015-04-22 作者:市場部 文章來源: 瀏覽:4253

如何選擇二抗

二抗:二抗是在其它宿主體內制備的能與一抗或一抗片段結合的抗體,上面通常連有酶或熒光素等標簽。由于二抗所具備的優點使得其在免疫學實驗中得以應用廣泛,如western blot(通過與特異性抗體結合來鑒定蛋白質),ELISA(以耦聯有酶的抗體或抗原為標記來檢測特異性的蛋白質,尤其是相應的抗原或抗體),免疫組織化學(檢測組織中的特異性抗原),免疫細胞化學(通過免疫學方法檢測細胞的抗原組成),流式細胞術(通過檢測激光所激發熒光來鑒定分離不同類型的細胞)及免疫沉淀(通過抗原與抗體的特異性結合作用來分離相應抗原)。

二抗針對某一特定物種(如小鼠)的所有抗體均具有特異性,因而使用標記的二抗可以免去對每一個一抗進行標記,大大節省了時間和費用;此外,一個一抗分子可以同時結合幾個二抗分子,從而使信號大大增強,提高了實驗靈敏度。二抗可以耦聯有幾種不同的標記,可以是酶,熒光素,或生物素。

如何選擇二抗?通常情況下,某一特定的實驗中可能同時有幾種二抗可供選擇,如何能選擇到最適合該實驗的二抗,需要綜合以下幾個方面進行考慮: 


1. 一抗的種屬來源

二抗應選用與使用的一抗相同的物種來源,例如:如果你的一抗是小鼠源的單克隆抗體,二抗則選抗小鼠的二抗(山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可);如果一抗是從兔血清里制備的兔源多克隆抗體,則相應的二抗需要選擇抗兔的二抗。即根據一抗的物種來源選擇相應的抗該物種的二抗。


2. 一抗是屬于哪個類或亞類   

除了要與一抗的種屬來源相一致,二抗還需與一抗的類別或亞類相匹配,這通常是針對單克隆抗體而言。一般來說多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白,因此相應的二抗就是抗IgG抗體。而單克隆抗體則相對復雜些,由于單克隆抗體有不同的類別和亞型,因此相應的二抗也需要根據這些亞型進行選擇。

單克隆抗體的類別及亞類通常會在產品說明書中都會有描述,如果您的一抗是小鼠IgM,那么相應的二抗就應當是抗小鼠IgG抗體。如果單克隆一抗是小鼠 IgG的某一亞類(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3),那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結合,或者您也可以選擇專門針對這一亞類的二抗,例如,如果您的一抗是小鼠IgG1,那么您可以選擇抗IgG1的二抗,此種抗體在雙標記實驗中尤其適合。在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下,可以選用抗相應物種IgG,因為此種抗體可以識別大多數類型的IgG免疫球蛋白。


3. 二抗的種屬來源

一般來說,不同的種屬來源與二抗的質量沒有必然的聯系,來源于山羊的二抗與來源于驢的二抗在一般的實驗里沒有太多的差別。然而在一些特殊的實驗里,如雙標實驗里,如果其中一個一抗是山羊來源的,一個是小鼠來源的,則相應的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗,這時候,二抗就不能選擇山羊或者小鼠來源的。選擇相應的驢來源的二抗,就非常適合做類似雙標的免疫實驗。雙標得2個都抗才行,故選擇第3個種源的抗體。


4. 選擇哪種形式的二抗,是整個IgG分子,F(ab')2片段,還是Fab片段?

整個IgG分子:此種抗體適用于多數情況。

F(ab')2片段:該種抗體是由兩個靠二硫鍵連接的用于結合抗原的Fab片段組成,這些抗體用在特定的情況中,如需要避免抗體與具有Fc受體的細胞結合的情況。

Fab片段:它們只有一個結合位點,一般用來封閉內源性免疫球蛋白。


5. 二抗的耦聯標記

一般來講,耦聯到二抗上的探針主要有酶(辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP,PAP),熒光基團(FITC, RRX, TR, PE)和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗。對于western blot和ELISA,最常用的二抗是酶標二抗,而細胞或組織標記實驗(細胞免疫化學,組織免疫化學,流式細胞術)中通常使用熒光基團標記的二抗,免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號,可以使用biotin/avidin檢測系統。在一些熒光檢測方案中,則需要選擇不同的熒光標記;而金顆粒標記的二抗則更多的應用于免疫電鏡中。


6. 抗體的純度

親和層析純化的抗體一般更受人們歡迎,因為這些產品的純度最高,產生的非特異性背景最少。但是有些情況下也要考慮到純化過程中損失的IgG部分,因為其中含有親和力很高的抗體,尤其是當目的抗原存在的量很小的時候,高親和性的IgG部分就顯得尤為重要。

總結幾種具有不同特異性的二抗


針對整個抗體分子(H+L)具有特異性:

如anti-IgG(H+L),此類抗體既可以與抗體的重鏈結合也可以與輕鏈結合,即與抗體分子的Fc,F(ab')2/Fab部分均可反應,anti- IgG(H+L)也可以與其他免疫球蛋白家族反應(如IgM和IgA),因為所有的免疫球蛋白都具有相同的輕鏈(κ鏈或λ鏈)。


針對Fab片段具有特異性:

這類抗體與重鏈輕鏈均可以結合,由于它們可以與輕鏈反應,它們同時也可以和具有相同輕鏈的其他種類的免疫球蛋白反應。


針對Fc片段或重鏈具有特異性:

這類抗體和重鏈的Fc部分反應,因此它們是類別特異性的。即gamma鏈特異性抗體只與IgG反應,mu鏈特異性抗體只識別IgM,依此類推。


輕鏈(lambda,kappa)特異性:

與所有類別的抗體反應,因為所有類別的抗體均具有相同的lambda鏈或kappa鏈。


經過吸附處理的二抗:

不同來源的免疫球蛋白含有相似的結構,抗一個物種的抗體可能與其他物種發生交叉反應,因此有些二抗經過了動物或人類IgG吸附處理,以減少非特異性背景。 例如,如果是小鼠的組織或細胞,那么選擇經小鼠血清或IgG吸附處理過的二抗可以減少非特異性結合。但是此種抗體識別表位的數量被大大減少。


二抗探針的優缺點及其適用的實驗

酶:

主要有兩種不同的酶耦聯物,HRP和AP。比較而言,前者更經濟、快速、穩定,而后者較前者更為靈敏,通常情況下,HRP廣泛應用于免疫組化,western blot和ELISA中,而堿性磷酸酶(AP)更適合于固相的免疫檢測實驗,如ELISA和western blot。

熒光基團:

FITC:FITC是廣泛使用的熒光基團,但其最大的缺點是淬滅快,使用抗淬滅劑可以減輕。

AMCA:常用在多標記實驗中,如免疫熒光、流式細胞術。其缺點是,淬滅快,且由于肉眼不能很好的檢測其所激發的藍色熒光,因而AMCA耦聯的二抗更適用于檢測大量存在的抗原。

花青染料(Cy2,Cy3,Cy5):Cy2比FITC更穩定,且在表面熒光顯微鏡下,Cy2的熒光FITC更強。Cy3和Cy5比大多數熒光基團更亮,更穩定,背景更弱。二者常在共聚焦顯微實驗中作多標記。但Cy5的缺點是不能用表面熒光顯微鏡觀察,因此通常用具有遠紅外檢測器的共聚焦顯微鏡觀察。

TRITC,RRX,TR:TRITC經常和FITC一起用于雙標記實驗中,也可以使用RRX或TR,但TR會產生較高的背景。在使用裝有氪氫燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標記實驗時,RRX尤其有用,可以和Cy2(或 FITC)及Cy5一起使用,因為RRX的發射波長在Cy2和Cy5中間,且和這兩者的重疊很少。

PE:常和FITC一起用于流式細胞術雙標記實驗。

生物素:

生物素(biotin)可以和抗生素蛋白(avidin)發生不可逆反應而緊密結合在一起。首先加入生物素標記的二抗,在加入耦聯有酶或熒光集團的 avidin、ExtrAvidin或streptavidin,后者能夠結合于二抗表面的多個位點上,從而極大的放大檢測信號。

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